Mysz Kaguya

Mysz Kaguya (3 lutego 2003 – 2005[1]) – mysz domowa, pierwszy ssak powstały z połączenia materiału genetycznego dwóch samic, który dożył wieku dorosłego[2][3].

Kaguya urodziła się 3 lutego 2003 roku i padła po 793 dniach, co wskazywało, że posiadanie genów od dwóch samic może wydłużać długość życia[1]. Była pierwszym zdolnym do życia ssakiem partenogenetycznym[4]. Jej imię zaczerpnięto z japońskiej baśni o księżycowej księżniczce Kaguya-hime[3].

Rozmnażanie partenogenetyczne występuje m.in. u roślin, owadów i gadów[3][5]. U ssaków prawidłowy rozwój embrionu wymaga udziału zarówno genomu matczynego, jak i ojcowskiego. Ssacze zarodki zawierające jedynie matczyny materiał genetyczny obumierają na wczesnym etapie embriogenezy, u myszy – w ciągu 10 dni, u owcy i świni – 21 dni[6]. Przeszkodą w rozwoju embrionów ssaków na drodze partenogenezy jest imprinting genomowy[4][6].

Przebieg eksperymentu

Kaguya była rezultatem eksperymentu przeprowadzonego przez zespół naukowców pod kierownictwem Tomohiro Kono, biologa z Tokyo University of Agriculture. Wyhodowano ją dzięki zwiększeniu aktywności genu Igf2 i monoallelicznej ekspresji genu H19 w partenogenetycznych zarodkach. W tym celu stworzono zmodyfikowane genetycznie myszy mające delecję o wielkości 13 kb (tysięcy par zasad) w jednostce transkrypcyjnej i regionie o zróżnicowanej metylacji genu H19, które zostały dawcami oocytów. Delecja ta umożliwiła ekspresję Igf2[2][5]. W normalnym embrionie ekspresji ulega matczyna kopia genu H19 i ojcowska kopia genu Igf2. Rozwój zarodka zawierającego wyłącznie ojcowskie chromosomy (H19 jest wyciszony) jest upośledzony i kończy się jego śmiercią. W embrionie zawierającym wyłącznie matczyne chromosomy (Igf2 jest wyciszony) dochodzi do niedorozwoju tkanek pozazarodkowych, co skutkuje jego obumarciem[5].

Zmodyfikowane genetycznie myszy uzyskano przez iniekcję celowanych komórek CCE ES do blastocyst myszy ze szczepu C57BL/6J, a następnie skrzyżowano wstecznie z samicami ze szczepu C57BL/6J. Od powstałych jednodniowych myszy pobrano oocyty w diplotenie[2]. DNA tych komórek nie miało w pełni nałożonego matczynego imprintingu, przez co imitowały one plemniki[2][3][5]. Od myszy ze szczepu B6D2F1 pobrano oocyty na etapie pęcherzyka zarodkowego i owulowane oocyty w metafazie II. Następnie za pomocą inaktywowanego wirusa Sendai dokonano fuzji oocytów diplotenowych z pozbawionymi jąder oocytów na etapie pęcherzyka zarodkowego. Zrekonstruowane oocyty hodowano w pożywce MEM przez 14 godzin do osiągnięcia przez nie stadium metafazy II. Potem ich jądra przeniesiono do owulowanych oocytów w metafazie II. Następnie zrekonstruowane oocyty aktywowano chemicznie. Uzyskane embriony hodowano przez 3 dni w pożywce M16, w atmosferze 5% dwutlenku węgla, 5% tlenu i 90% azotu, w temperaturze 37 °C[2][6].

Otrzymane blastocysty wszczepiono do macic 26 samic, z czego 24 zaszły w ciążę. Łącznie wszczepiono 343 zarodki, z czego 246 (71,7%) się zagnieździło. Na świat przyszło 28 młodych, z czego 18 martwych i 10 żywych. Z 10 żywo urodzonych młodych przy życiu utrzymały się tylko 2, reszta była opóźniona w rozwoju i padła w ciągu 15 minut. Z dwóch myszy, które przeżyły, jedną nazwano Kaguya, dożyła ona okresu dorosłości i po kopulacji z samcem wydała na świat zdrowe potomstwo. Drugą mysz uśmiercono w celu wykorzystania do analizy ekspresji genów. Wyniki eksperymentu opublikowano na łamach „Nature” w kwietniu 2004 roku. Dostarczyły one bezpośrednich dowodów, że imprinting genomowy blokuje rozwój ssaczych embrionów na drodze partenogenezy[2][6].

Analiza fenotypów

Fenotypy myszy partenogenetycznych były podobne do grupy kontrolnej. Grubość pępowiny myszy partenogenetycznych mieściła się w normie, ale masa ich łożysk była znacząco mniejsza niż w grupie kontrolnej. Masa urodzeniowa myszy partenogenetycznych, które przeżyły, była zbliżona do masy myszy w grupie kontrolnej. Badanie histopatologiczne opóźnionych w rozwoju żywo urodzonych młodych wykazało niedorozwój wątroby i atrofię łożyska, ale z zachowaną funkcjonalnością. Masa urodzeniowa ciała była też znacząco mniejsza niż masa myszy z grupy kontrolnej[2].

Analiza ekspresji genów

Analiza techniką mikromacierzy oligonukleotydowych pokazała, że[2]:

  • wszystkie analizowane geny podlegające piętnowaniu uległy ekspresji na znormalizowanym poziomie u myszy partenogenetycznych, jedynie dwa z tych genów: Grb10 i Nnat wykazywały odpowiednio dwukrotnie zwiększoną lub dwukrotnie zmniejszoną ekspresję u myszy partenogenetycznych niż w grupie kontrolnej,
  • od 11 do 42 (średnio 30) genów wykazywało różnicę w ekspresji genów większą niż dwa razy w porównaniu z grupą kontrolną, wśród nich tylko gen Dlk1 wykazywał zmiany w ekspresji u wszystkich badanych osobników partenogenetycznych.

Analiza ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że[2]:

  • geny IGF2 i H19 były eksprymowane na podobnym poziomie w głównych organach u myszy partenogenetycznych, co w grupie kontrolnej,
  • gen Gtl2 był eksprymowany na poziomie dwa – cztery razy wyższym u osobników opóźnionych w rozwoju niż w grupie kontrolnej,
  • gen Dlk1 eksprymowany był w płucach, mięśniach i sercu w grupie kontrolnej, tylko w płucach i mięśniach u myszy partenogenetycznej, która przeżyła, a u opóźnionych w rozwoju tylko w mięśniach.

Badacze stwierdzili, że spadek ekspresji Gtl2 i aktywacja Dlk1 mogły być jedną z przyczyn normalnego rozwoju dwóch partenogenetycznych myszy, które przeżyły. Oba geny podlegają imprintingowi w trakcie spermatogenezy[2].

Przypisy

  1. ↑ a b Kawahara M, Kono T. Longevity in Mice Without a Father. „Human Reproduction”. 25 (2), s. 457–461, 2010. DOI: 10.1093/humrep/dep400. PMID: 19952375. 
  2. ↑ a b c d e f g h i j Kono T, et al. Birth of Parthenogenetic Mice That Can Develop to Adulthood. „Nature”. 428 (6985), s. 860–864, 2004. DOI: 10.1038/nature02402. PMID: 15103378. [dostęp 2016-03-02]. 
  3. ↑ a b c d Vogel G. Japanese Scientists Create Fatherless Mouse. „Science”. 304 (5670), s. 501–503, 2004. DOI: 10.1126/science.304.5670.501a. PMID: 15105467. 
  4. ↑ a b Moore T, Ball M. Kaguya, the First Parthenogenetic Mammal – Engineering Triumph or Lottery Winner?. „Reproduction”. 128 (1), s. 1–3, 2004. DOI: 10.1530/rep.1.00311. PMID: 15232058. 
  5. ↑ a b c d Loebel DA, Tam PP. Genomic Imprinting: Mice Without a Father. „Nature”. 428 (6985), s. 809–811, 2004. DOI: 10.1038/428809a. PMID: 15103360. 
  6. ↑ a b c d Kono T. Genomic Imprinting Is a Barrier to Parthenogenesis in Mammals. „Cytogenetic and Genome Research”. 113 (1–4), s. 31–35, 2006. DOI: 10.1159/000090812. PMID: 16575160.